Аллельные варианты генов-кандидатов подверженности туберкулезу у русского населения Западной Сибири

Примечание. Обозначения см. табл. 19; * - над диагональю показан уровень р для сравнения частот аллелей, под диагональю - уровень р для сравнения частот генотипов

Таблица 22 Частоты генотипов и аллелей в выборках больных туберкулезом с разным объемом поражения ткани легкого в сравнении с контрольной группой

Примечание. Обозначения см. табл. 19

Найденная связь 274С/Т гена NRAMP1 представляется закономерной, поскольку этот полиморфизм также показал ассоциацию с деструктивным туберкулезом, а процессы некроза ткани и распространения воспаления взаимосвязаны. Обнаружена ассоциация генотипа 1188С/С IL12B с распространенным туберкулезным процессом. К тому же, учитывая результаты, полученные при сравнении общей группы больных туберкулезом и здоровых, а также данные анализа семейной выборки, можно суммировать, что у индивидов - обладателей генотипа 1188С/С IL12B предрасположенность к туберкулезу выше, чем у обладателей генотипов 1188А/А и 1188А/С, причем носители генотипа 1188С/С в большей степени рискуют заболеть тяжелым распространенным туберкулезом с деструкцией легочной ткани.

Несмотря на то, что биологические эффекты IL-1? и IL-1RN разнонаправленные, показано, что аллель +3953 А2 IL1В и аллель А2 VNTR полиморфизма IL1RN предрасполагают к возникновению распада легочной ткани при туберкулезе. Однако, что касается распространенности туберкулезного поражения, то аллель +3953 А2 IL1В ассоциирован с небольшой (1-2 сегмента) зоной воспаления, а аллель А2 VNTR полиморфизма IL1RN, напротив, с распространенным процессом.

Таким образом, полиморфизмы 469+14G/C гена NRAMP1 и B/b гена VDR оказывают влияние на течение возникшего заболевания. Изменчивость 274С/Т гена NRAMP1, 1188А/С IL12B, +3953А1/А2 IL1B и VNTR IL1RN предрасполагают к возникновению ТБ, причем все перечисленные маркеры кроме изученного полиморфизма гена IL1B способствуют заболеванию распространенным деструктивным туберкулезом. Полиморфизм +3953А1/А2 гена IL1B обусловливает подверженность к ограниченному туберкулезу с деструкцией ткани легкого у русских г. Томска.

При изучении ассоциаций с патогенетически важными для ТБ качественными признаками у тувинцев выявлена связь генетических маркеров с деструктивным процессом в легком.

Ассоциированными с распадом ткани легкого при туберкулезе оказались полиморфизм B/b гена VDR и полиморфизм VNTR гена IL1RN [Рудко А.А., 2004]. При сравнении найденных у тувинцев и русских ассоциаций можно отметить, что в обеих группах показана связь полиморфизма VNTR (аллеля А2) гена IL1RN с деструкцией при туберкулезе.

Наряду со сходством показаны и отличия. У русских г. Томска этот полиморфизм оказывал влияние на уровне предрасположенности к ТБ, тогда как у тувинцев обусловливал различное клиническое проявление возникшего заболевания. Как у русских, так и у тувинцев найдено влияние полиморфизма B/b гена VDR на течение туберкулезной инфекции. В выборке жителей г. Томска аллель b был ответственен за небольшой объем поражения легкого, а у тувинцев - за отсутствие деструкции при ТБ.

3.4.2 Анализ ассоциаций исследованных генов с количественными признаками туберкулеза

Туберкулез характеризуется специфическими проявлениями признаков, многие из которых имеют не качественную, а количественную природу. В связи с этим, одним из важных аспектов изучения генетических основ туберкулеза представляется анализ наследственной составляющей количественных признаков, существенных в патогенезе заболевания. С целью оценки влияния полиморфизма генов NRAMP1, VDR, IL1B, IL12B, IL1RN на течение туберкулезного процесса проведен поиск ассоциаций изучаемых маркеров с количественными, патогенетически важными признаками туберкулеза.

В эту часть исследования включили группу больных вторичным туберкулезом легких (181 человек), которую на 91% (165 человек) составили пациенты с распространенным туберкулезом, остальным был выставлен диагноз очагового туберкулеза легких и туберкулемы. Для остальных пациентов с вторичным ТБ показатели общего анализа крови на момент начала заболевания оказались недоступны.

Оценивали влияние изученных полиморфизмов на показатели крови при туберкулезе легких: гемоглобин, эритроциты, лейкоциты, скорость оседания эритроцитов (СОЭ), уровень палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов, эозинофилов, лимфоцитов и моноцитов. Известно, что некоторые параметры крови зависят от пола и возраста индивида. Так, у русских г. Томска, больных туберкулезом показана зависимость от пола и возраста для лейкоцитов, СОЭ и моноцитов. В связи с этим перечисленные показатели анализировали отдельно в группе мужчин и женщин, к тому же вводилась поправка на возраст. Учитывая статистически значимые отклонения распределений большинства исследованных признаков от закона Гаусса по данным теста Колмогорова-Смирнова, сравнение проводилось с помощью непараметрических критериев Краскела-Уоллиса и Манна-Уитни [Гланц С., 1998].

Обнаружены ассоциации исследованных генов с рядом количественных показателей (табл. 23). Для полиморфизма 1188А/С гена IL12B показана связь с уровнем СОЭ и выраженностью палочкоядерного сдвига влево лейкоцитарной формулы, при этом генотип 1188А/С ассоциирован с повышением уровня палочкоядерных нейтрофилов независимо от пола больного и со значительным повышением уровня СОЭ у женщин при туберкулезе. В норме у женщин скорость оседания эритроцитов состаляет от 4 до 15 мм в час [Гольдберг Е.Д., 1989]. Так, полиморфизм 1188А/С гена IL12B проявил дифференциальное влияние на уровень СОЭ у представителей разного пола.

Полиморфизм F/f гена VDR проявил ассоциацию с уровнем сегментоядерных нейтрофилов. Среднее количество сегментоядерных нейтрофилов для обладателей генотипа ff составило 54%, в то время как для носителей других генотипов этот показатель равнялся 59%. В норме у здоровых уровень сегментоядерных нейтрофилов составляет 42,9% - 59,3% [Гольдберг Е.Д., 1989]. Таким образом, выявленная ассоциация прогностически нейтральна для туберкулеза, поскольку средний уровень сегментоядерных нейтрофилов при любом варианте гена оставался в пределах нормы. Для полиморфизмов генов NRAMP1, IL1B, IL1RN и варианта B/b гена VDR не показано связи с количественными признаками туберкулеза.

Таким образом, с помощью дисперсионного анализа удалось установить ассоциацию гена IL12B с количественными патогенетически важными признаками туберкулеза: палочкоядерным сдвигом лейкоцитарной формулы влево и с уровнем СОЭ у женщин. Известно, что степень ядерного сдвига нейтрофилов влево и уровень повышения СОЭ совпадают с активностью и тяжестью туберкулезного процесса [Шмелев Н.А., 1959; Кан Е.Л., 1972].

Таблица 23 Средние значения количественных признаков у носителей разных генотипов исследованных полиморфизмов

Примечание. N - численность генотипов; S.D. - стандартное отклонение; р - достигнутый уровень значимости; * - указаны генотипы, для которых сравнивали среднее значение признака

Важным обстоятельством является то, что ген IL12B проявил связь, как с туберкулезом, так и с качественными и количественными признаками заболевания. Кроме того показана ассоциация IL12B с туберкулезом, выявленная при помощи TDT - теста, анализирующего семейные данные. Это свидетельствует о неслучайном характере полученных ассоциаций и о том, что изученный ген играет важную роль в формировании подверженности к туберкулезу у русского населения г. Томска. Однако в исследовании тувинцев не показано ассоциаций с этим геном [Рудко А.А., 2004].

Интересным представляется то, что у жителей Тувы при поиске ассоциаций с количественными признаками туберкулеза найдена связь полиморфизма B/b гена VDR с количеством палочкоядерных нейтрофилов и полиморфизма VNTR гена IL1RN с уровнем СОЭ. Аллель b гена VDR оказался ассоциирован с нормальным количеством палочкоядерных нейтрофилов при туберкулезе, а аллель В - с палочкоядерным сдвигом влево лейкоцитарной формулы. Аллель А2 гена IL1RN проявил связь со значительным повышением СОЭ при ТБ у тувинцев [Рудко А.А., 2004]. В целом можно отметить, что при сравнении полученных ассоциаций полиморфизмов с качественными и количественными параметрами туберкулеза у русских г. Томска и у жителей Тувы найдены отличия по всем исследованным признакам, что говорит об этнической зависимости генетических основ подверженности к туберкулезу.

Заключение

При изучении роли генов-кандидатов подверженности туберкулезу в этиологии и клинических проявлениях заболевания использован следующий алгоритм работы. На первом этапе проведен анализ популяционной распространенности исследуемых полиморфизмов. Второй этап заключался в определении ассоциаций генетических маркеров с туберкулезом. Третий этап включал поиск связи аллельных вариантов генов с качественными и количественными патогенетически значимыми параметрами заболевания. Кроме того, проведен сравнительный анализ полученных результатов с исследованием тувинской популяции, выполненным ранее по той же методологии [Рудко А.А., 2004].

Изучена популяционная распространенность полиморфных вариантов генов NRAMP1, VDR, IL1B, IL1RN, IL12B у русских г. Томска. Это дало возможность провести сравнение между характерными особенностями распространения аллелей генов-кандидатов туберкулеза в различных популяциях мира. При этом выявлена специфичность их распространения у жителей г. Томска. Результаты сравнительного анализа представляются важными с точки зрения обнаружения связи между особенностями распределения частот аллелей генов-кандидатов туберкулеза и заболеваемостью этой инфекционной патологией в различных популяциях.

При сравнении частот аллелей и генотипов у русских и тувинцев показаны отличия практически по всем исследованным полиморфизмам, кроме варианта 274С/Т гена NRAMP1, однако статистические показатели сравнения генотипов для этого полиморфизма были пограничными (р=0,064). Структура неравновесия по сцеплению между парами полиморфных вариантов гена NRAMP1 оказалась идентичной у русских и тувинцев. Неравновесие между другими исследованными генетическими маркерами отличалось в изученных этнических группах. При сравнении частот аллелей и генотипов у больных туберкулезом русских и тувинцев выявлены отличия по всем полиморфизмам. В целом при межпопуляционном сравнении особенностий распределения аллелей генов-кандидатов ТБ и складывающихся межлокусных взаимодействиях у русских и тувинцев выявлены значительные отличия, что представляется важным с точки зрения генетической эпидемиологии.

Первостепенное внимание было уделено поиску ассоциаций полиморфизма генов NRAMP1, VDR, IL1B, IL1RN, IL12B с туберкулезом. Основой в проведенном исследовании вклада генов-кандидатов туберкулеза в формирование подверженности к заболеванию служил комплексный подход, заключающийся в характеристике полиморфизма этих генов, как на популяционном уровне, так и на семейном. При сравнении частот аллелей и генотипов у больных и здоровых установлена связь полиморфизма 1188А/С IL12B с туберкулезом (р=0,044 и р=0,035 соответственно), причем у носителей генотипа 1188С/С риск заболеть первичным туберкулезом возрастал в 13 раз, а вторичными формами инфекции - в 8 раз. Полученная связь генетического маркера с патологией методом случай-контроль подтверждена на семейной выборке больных. Дети с туберкулезом лишь в 13% случаев наследовали от родителей аллель 1188А, тогда как аллель 1188С - в 87% (TDT=8,07, р=0,005). С другими исследованными генами-кандидатами туберкулеза ассоциаций по данным теста TDT не получено. Также показано, что полиморфизм 1188А/С гена IL12B ассоциирован не с любым клиническим вариантом вторичного туберкулеза легких, а лишь с распространенным (объем поражения - более одной доли) (р=0,022), деструктивным ТБ (р=0,012).

Выявлено наличие ассоциации с заболеванием полиморфизма 1465-85G/A гена NRAMP1. У заболевших первичным туберкулезом чаще, чем в контрольной группе встречался гетерозиготный генотип 1465-85G/A (р=0,004), риск заболевания у этих индивидов был в 3 раза выше, чем у обладателей других генотипов этого полиморфизма. К тому же показана протективная роль в отношении первичного туберкулеза для генотипа 1465-85G/G NRAMP1.

Показана связь полиморфизма 274С/Т гена NRAMP1 с вторичным туберкулезом легких, причем с деструктивными (р=0,005) и распространенными (р=0,002) формами. Индивиды с генотипом 274С/Т преобладали в 1,66 раза в группе больных по сравнению с контролем. Лица, обладающие генотипом 274С/C, статистически значимо чаще встречались среди здоровых (OR=0,54).

В результате проведенного анализа установлена значимость VNTR полиморфизма гена IL1RN при туберкулезе. Частота аллеля А2 была выше в группе больных по сравнению с контролем (р=0,023). При сравнении частот генотипов выявлена предрасполагающая к ТБ роль гетерозигот А1/А2 (OR=2,10, р=0,030). Установлено, что выявленная ассоциация VNTR гена IL1RN c патологией обусловлена связью этого полиморфизма с вторичными формами туберкулеза легких, так как распределение генотипов различалось в группах лиц с вторичным генезом заболевания и здоровых (р=0,025), а в выборках с первичным туберкулезом и контрольной отличий не показано. Кроме того выявлена связь этого маркера с распространенным (р=0,018) и деструктивным (р=0,017) вторичным туберкулезом легких.

Ген IL1B, продукт экспрессии которого является провоспалительным цитокином, проявил статистически значимую связь с вторичным деструктивным туберкулезом легких. Аллель А2 полиморфизма +3953 этого гена чаще определяли у больных, чем у здоровых (р=0,008). Распределение генотипов в группе больных деструктивными формами заболевания и здоровых также различалось (р=0,022). Кроме того аллель А2 оказался ассоциирован с небольшим объемом туберкулезного поражения в легком (1-2 сегмента) (р=0,015) (рис. 6)

При определении неравновесия между полиморфизмами генов IL1B и IL1RN показано, что аллель +3953А1 и аллель А1 полиморфизма VNTR находятся в фазе отталкивания, мера неравновесия для них составила -0,033 (р=0,009). При сравнении частоты гаплотипа IL1RN*A1A1/IL1B*A1A1 в группах больных туберкулезом и здоровых индивидов найдено, что статистически чаще это сочетание встречается в контрольной выборке (р=0,003). При этом риск заболеть туберкулезом у носителей этого гаплотипа был равен 0,50. Таким образом, гаплотип IL1RN*A1A1/IL1B*A1A1 имеет протективный эффект и защищает его обладателя от заболевания туберкулезом.

При анализировании анамнестических данных показано, что родственники индивидов больных туберкулезом, не имеющие контакта с пробандами, страдают от этого заболевания чаще, чем родственники здоровых людей (OR=3,63, p<0,000). Это свидетельствует о наследственной предрасположенности к туберкулезу.

При сравнении выявленных ассоциаций исследованных генов с ТБ у русских г. Томска и коренных жителей Тувы показаны значительные отличия. Результаты, полученные при изучении тувинского этноса, свидетельствуют о незначительном вкладе исследованных полиморфизмов в формирование подверженности к туберкулезу [Рудко А.А., 2004]. У жителей г. Томска, напротив, получены ассоциации для 5 из 9 исследованных полиморфизмов генов-кандидатов предрасположенности к ТБ. Такие отличия в проявлении эффекта изученных генов, вероятно, обусловлены разным генетическим фоном у русских и тувинцев. Известно, что каждый ген действует не самостоятельно, а во взаимодействии со множеством других генов, следовательно, эффекты генов проявляют зависимость от того генетического фона, на котором действует ген.

Установлено, что полиморфизмы 469+14G/C гена NRAMP1 и B/b гена VDR не предрасполагают к туберкулезу, однако они оказывают влияние на течение возникшего заболевания. При сравнении распределений генотипов и частот аллелей 469+14G/C гена NRAMP1 в группах больных туберкулезом с деструкцией легочной ткани и больных туберкулезом без деструкции выявлены статистически значимые отличия. Так, частота аллеля 469+14С этого гена в выборке больных с экссудативно-некротическим и пролиферативно-некротическим типом воспалительной реакции была выше, чем в группе больных с пролиферативными и экссудативным типом воспалительной реакции (р=0,027). Кроме того, этот полиморфизм оказался значимым в определении обьема поражения при туберкулезе легких. Частота аллеля 469+14С в группе больных распространенным туберкулезом превышала таковую в группе больных с ограниченной формой заболевания (р=0,016).

Таким образом, можно говорить о вкладе 469+14С аллеля гена NRAMP1 не только в формирование деструкции при туберкулезе, но и в увеличение зоны поражения. Показано влияние полиморфизма B/b гена VDR на распространенность зоны туберкулезного поражения, поскольку аллель b статистически значимо чаще выявляли у больных с легочным поражением в пределах 1-2 сегментов (р= 0,011).

Обнаружены ассоциации исследованных генов с рядом количественных показателей. Для полиморфизма 1188А/С гена IL12B показана связь с уровнем СОЭ и выраженностью палочкоядерного сдвига влево лейкоцитарной формулы, при этом аллель 1188С ассоциирован с повышением палочкоядерных нейтрофилов независимо от пола больного (р=0,031), а генотип 1188АС - с значительной степенью повышения СОЭ у женщин (р=0,010) (рис. 7).