Методы физиологических исследований

(Г) Активация и возможная модификация нервных цепей, вызванная обучением, может отражаться в локальных изменениях метаболизма медиаторов, нуклеиновых кислот и белков.

Нейрофизиологическое исследование направлено на учет ди-намики поведения и пространственно-временной организации активности головного мозга. Приобретение нового опыта, ведущего к образованию энграммы (обучение), может осуществляться с участием нервных сетей, отличных от тех, которые участвуют в последующем воспроизведении зафиксированного опыта. Место накопления информации может быть точкой конвергенции отдель-ных механизмов записи и считывания. Эффективность приобрете-ния опыта и воспроизведения его зависит от таких факторов, как уровень бодрствования, мотивации и эмоции. Все эти переменные должны учитываться при объяснении изменений поведения, вы-званных стимуляцией и разрушением, и объяснении соотношения между поведенческими, электрическими или биохимическими сдвигами. Очень трудно отличить специфические механизмы, общие для целого класса реакций (например, аппетентные и аверзивные).

Общее описание нервных структур, участвующих в различных формах поведения, - необходимое условие для подробного исследования клеточных и молекулярных изменений, лежащих в основе пластических перестроек нервных сетей. Имеющиеся электрофизиологические, нейрохимические и морфологические микрометоды полностью отвечают такому требованию при условии их примене-ния в соответствующее время и в существенно важных звеньях. Создание подходящей поведенческой модели, пригодной для эффективного применения микрометодов, является предпосылкой дальнейших быстрых успехов. А пока исследования концентрируются на функциональной организации нервных сетей, участвую-щих в различных процессах, таких, как обработка сенсорных сигналов, мотивация, образование следов памяти, местонахождение энграммы и т. д.

Планирование экспериментов

Для планирования опытов необходимо знать принципы и тактику исследования, научного подхода, которые лучше всего формиру-ются при непосредственном осуществлении опытов. Данная книга - практическое руководство к проведению опытов. При этом предполагается, что читатель знаком с основными принципами статистики. Вводные практические советы по проведению опытов по физиологии поведения можно найти у Сидовски и Локарда (Sidowski and Lockard, 1966) и Вейнера (Wayner, 1971). Ниже приводится краткое описание, цель которого сориентировать студентов на некоторые сложные проблемы, связанные с планирова-нием опытов и их проведением.

Преимущество лабораторного изучения перед натуралистиче-ским наблюдением заключается в том, что исследователь может контролировать условия опыта, т. е. устанавливать точный контроль за так называемыми независимыми переменными, чтобы выявить их влияние на зависимые переменные. Зависимыми переменными в физиологической психологии могут быть любые по-веденческие или физиологические характеристики, тогда как независимые переменные - это условия, которые контролируются экспериментатором и иногда навязываются организму. Под условиями подразумевают прямое вмешательство (удаление отделов головного мозга, его стимуляция или применение различных препаратов), изменение окружающей среды (температуры и освещенности), изменение режима подкрепления, сложность зад-ний по обучению, длительность пищевой депривации или такие факторы, как возраст, пол, генетическая линия и т. д.

Чтобы свести до минимума неправильное толкование опытов, связанное со сложностью отличить эффекты экспериментальных вмешательств от воздействий других переменных, необходимо ввести контрольные процедуры. Так, например, при тестировании эффективности определенной процедуры (независимая переменная) используется контрольная группа. В идеальном варианте контрольную группу исследуют так же, как и экспериментальную, исключая воздействие изучаемого фактора, ради которого и намечается сам эксперимент. Одно и то же животное можно использовать и в контроле, и в эксперименте, если, например, необходимо сравнить поведение его до и после удаления отделов головного мозга. Другая обычная контрольная процедура, цель которой состоит в уменьшении одновременного влияния переменных факторов, - это сбалансированное применение разных влияний на одном и том же животном (например, инъекции различных препаратов или различных доз одного и того же препарата). Еще одним важным моментом контроля является произвольное распределение животных по различным группам. Это лучше всего осуществлять с помощью таблицы случайных чисел, которая приводится во многих книгах по статистики (простой отлов животных из клетки для формирования группы не является адекваным, так как самые слабые или пассивные животные будут отловлены в первую очередь).

Из-за возможных ошибок или вариабельности получаемых результатов, вызванных неконтролируемыми переменными, измерения обычно повторяют и выявляют среднюю или медианную величину. При повторных измерениях проводят множественные наблюдения за теми же животными или же одно наблюдение за многими животными, или же и то и другое вместе. Чем больше вероятность ошибок или колебаний, связанных с некоторыми неизвестными или неконтролируемыми переменными, тем больше вероятность того, что повторные измерения будут отличаться и, таким образом, вариабельность измерений относительно средней величины будет выше. Статистический анализ обычно используется для оценки степени достоверности наблюдаемых различий между экспериментальными и контрольными группами или условиями опыта. Например, различие между двумя средними тради-ционно считается значимым (т. е. не случайным), когда вероятность того, что различие на самом деле является истинным, до-стигается не менее чем в 95 случаях из 100.

Научный анализ, основывающийся на натуралистических наблюдениях или на лабораторных опытах, опирается на измерения, с помощью которых наблюдениям придается количественный ха-рактер. От так называемого уровня измерения зависит, какие арифметические операции могут быть применены к числам, что, следовательно, и обусловливает использование соответствующих статистических методов. Исследователь должен учитывать уро-вень измерений и предвидеть природу статистической обработки результатов уже при планировании опытов, так как эти сообра-жения помогут решить вопрос о точности измерительных приборов и требуемом количестве опытов.

Необходимо различать четыре общих уровня измерения или оценки: номинальный, ординарный, интервальный и соотноситель-ный. Низшим уровнем является номинальный, где такие символы, как буквы или цифры, используются просто для классификации объектов или явлений. В этом случае количество измерений, по-падающих в различные классы в условиях эксперимента и контроля, сравниваются с использованием биномиальной статистики. Если возможно упорядочить наблюдения так, чтобы они находи-лись в каких-то отношениях один к другому (например, «больше чем», «меньше чем» и т. д.), то будем иметь дело с ординарной шкалой. Если, кроме того, можно обнаружить интервалы между числами на такой шкале, то будем иметь дело с интервальной шкалой, которая имеет произвольную нулевую точку (как в случае температурной шкалы). Если же шкала имеет еще и истинную нулевую точку в начале, как, например, шкалы высоты, массы, то будет достигнут наивысший уровень измерения, т. е. соотносительная шкала. Параметры, измеряемые с помощью номикалькой или ординарной шкалы, обрабатываются с применением непараметрической статистики (например, ч2-есты (Connover, 1971; Siegel, 1956)), тогда как данные, измеряемые по интервальной и соотносительной шкале, как правило, обрабатываются с помощью параметрических статистических методов (например, t-тесты) (если различные предположения о параметрах популя-ции, из которой взят пример, соответствуют данным). Параметры популяции, подвергаемые непараметрическим статистическим процедурам, не обязательно должны соответствовать определенным условиям, например нормальному распределению. Поэтому эти процедуры широко используются в опытах по физиологической психологии, где измерения, как правило, проводятся па ординарном уровне и объем выборки часто является небольшим. В план проведения опытов, описанных в этой книге, включено сопоставление экспериментальных и контрольных данных. Для таких данных, полученных из независимых событий, полезной непараметрической статистикой является U-гест Манна - Уитни. При использовании другой схемы опытов животное служит контролем самого себя, как в случае сравнения поведения до и после введения препарата и при удалении отделов головного мозга. Стандартной непараметрической оценкой для таких данных, полученных при наличии связанных событий, является критерий для сопряженных пар знаковых рангов Вилкоксона (Siegel, 1956). Кроме того, непараметрические методы используются для анализа данных, полученных в повторных текстах, по результатам которых и строят кривые обучения и кривые реактивности (Krauth, 1980).

В этой книге в качестве подопытных животных для большей части экспериментов используют крыс. Для подробного ознакомления с общими лабораторными процедурами, включая уход за животными и обращение с ними, в особенности с крысами, читателям рекомендуем обратиться к работам Бейкера с сотрудниками (Baker et al., 1979), Ферриса (Harris, 1957), Гудмана и Гилмана (Goodman and Oilman, 1975), Лейн-Петтера с сотрудниками (Lane-Petter et al., 1967), Леонарда (Leonard, 1968), Майерса (Myers, 1971 а), Манна (Munn, 1950) и Шорта и Вуднотта (Short

and Woodnott, 1969).

В поведенческих исследованиях чаще всего используют такие линии крыс, как капюшонные линии Лонг-Эванса; белые линии Спраг-Доули и Вистар. В целях получения и сопоставления результатов желательно применять стандартные линии. Однако степень универсальности результатов может зависеть от использо-вания нескольких линий (а также видов).

Для проведения опытов на животных необходимо содержать их в чистоте, удобстве и обезопасить от болезней. Этого можно достичь, руководствуясь подробно разработанными стандартами размещения, кормления, гигиены, постоперационного ухода (см. приведенные выше ссылки) и зная обычные заболевания живот-ных (Myers, 1971 a; Short and Woodnott, 1969).

Большая часть поведенческих опытов вызывает дискомфорт у животных, независимо от того, вызван ли он пищевой деприва-цией, использованием центральной или периферической аверсив-ной стимуляции, введением препаратов или просто поднятием животного в воздух. Экспериментатор должен постоянно помнить об этом и стараться по возможности уменьшить дискомфорт подопытного животного.

Ниже приводятся рекомендации для проведения опытов на животных, которые составляют один из разделов «Принципов использования животных» в «Руководстве к дотациям и контрактам Национального института здравоохранения США» от 1978 г.:

«1. Опыты, в которых используются живые позвоночные и ткани живых организмов для проведения исследований, должны выполняться под контролем квалифицированных ученых-биологов, физиологов или медиков.

2. Размещение, уход и кормление всех экспериментальных животных должны находиться под контролем квалифицированного ветеринара или другого ученого, компетентного в данных вопросах.

3. Исследование по своему характеру должно дать полезные результаты на благо общества и не должно быть случайным и бесполезным.

4. Эксперимент должен опираться на знание исследуемой болезни или проблемы и планироваться так, чтобы ожидаемые результаты оправдывали его проведение.

5. Статистический анализ, математические модели или биологические системы in vitro должны использоваться, если они соответственно дополняют результаты опытов на животных и позволяют сократить число используемых животных.

6. Опыты должны проводиться так, чтобы не подвергать животное ненужным страданиям и не наносить ему вреда.

7. Ученый, отвечающий за опыт, должен быть готов прекратить его, если он/она считает, что продолжение опыта может вызвать ненужное увечье или страдание животных.

8. Если сам опыт вызывает больше дискомфорта у животного, чем наркоз, то необходимо довести животное (путем применения наркоза) до состояния, когда оно не воспринимает боль, и поддерживать это состояние до тех пор, пока опыт или процедура не будут завершены. Исключение составляют только те случаи, когда наркоз может повредить цели опыта, а данные нельзя получить никаким иным способом, кроме как проведением подобных опытов. Такие процедуры должны тщательно контролироваться руководством или другим квалифицированным старшим сотрудником.

9. Постэкспериментальный уход за животным должен свести до минимума дискомфорт и последствия травмы, нанесенной животным в результате опыта, в соответствии с принятой практикой ветеринарной медицины.

10. Если необходимо умертвить экспериментальное животное, то это дела-ют так, чтобы достичь мгновенной гибели. Ни одно животное не должно быть уничтожено до тех пор, пока не наступит его смерть».

Почти во всех случаях поведенческого и нейрологического тестирования, которые описаны в последующих главах, необходимо брать животных в руки. Животное нужно приучать к этой процедуре на протяжении нескольких дней перед началом опыта. Такое обращение предполагает доставание животного рукой из клетки, помещение его на стол, осторожное поглаживание и перенесение с одного места на другое. Со временем животные перестают сопротивляться таким процедурам, если их осуществлять бережно.

Не держите животное за хвост и старайтесь не прихватить кожу и сильно не надавливать на животное. Лучше брать животное сзади под лопатки, подводя большой палец под одну переднюю конечность, а остальные пальцы - под вторую конечность. Сила захвата животного должна соответствовать сте-пени его сопротивления. Если животное держать так, чтобы его передние конечности перекрещивались, то оно не сможет укусить.

При частом взятии на руки лабораторные крысы становятся довольно ручными и ими легко управлять. Для введения препаратов желательно использовать помощника, при этом вторую ру-ку экспериментатор использует для вытягивания задних конечностей животного. При достаточной практике внутрибрюшинные инъекции можно производить самостоятельно, путем захвата зад-них конечностей крысы и одновременного инъецирования ее другой рукой.

Перед инъекцией полезно успокоить животное; для этого нужно захватить животное так, как это описано выше, и затем медленно раскачивать его вперед и назад по широкой дуге.

Обычным методом маркировки крыс является нанесение на уши животного прорезей или отверстий, пока оно находится под наркозом. Уши животного тонкие и не очень кровоточат. Предпочтительным является метод маркировки тела и хвоста каким-либо биологическим красителем, например желтой пикриновой кислотой или красным карбофуксином. Такая бинарная система позволяет осуществить индивидуальное кодирование 63 крыс. (Если исполь-зуете несколько крыс, то кодируйте их только четными числами, так как это уменьшает число необходимых отверстий или меток.)

АППАРАТУРА И МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ФУНКЦИЙ

Успехи современной физиологии в изучении функций целостного организма, его систем, органов, тканей и клеток во многом обусловлены широким внедрением в практику физиологического эксперимента электронной техники, анализирующих устройств и электрон-ных вычислительных машин, а также биохимических и фармакологических методов исследования. В последние годы в физиологии качественные методы дополняют количественными, что позволяет определять изучаемые параметры различных функций в соответствующих единицах измерения. Совместно с физиологами в разработке новых методических подходов участвуют физики, математики, инже-неры и другие специалисты.

Быстрое совершенствование электронной техники открыло новые пути для познания многих физиологических процессов, что ранее было принципиально невозможно.

Создание разнообразных систем датчиков, преобразующих неэлектрические процессы в электрические, совершенствование измеритель-ной и регистрирующей аппаратуры позволили разработать новые, высокоточные методы объективной регистрации (например, биотеле-метрия) физиологических функций, что в значительной мере расширило возможности эксперимента.

СХЕМА СВЯЗЕЙ МЕЖДУ ПРИБОРАМИ И ОБЪЕКТАМИ ИССЛЕДОВАНИЯ

При исследовании физиологических функций с использованием различной аппаратуры в эксперименте и клинике формируют своеобразные системы. Их можно разделить на две группы: 1) системы для регистрации различных проявлений жизнедеятельности и анализа полученных данных и 2) системы для воздействия на организм или его структурно-функциональные единицы.

Для того, чтобы наглядно представить взаимодействия отдельных элементов системы, необходимо рассмотреть их в виде блок-схем. Такие блок-схемы и их символы удобно использовать студентам для иллюстрации протоколов экспериментов во время практических занятий. По нашему мнению, подобная форма изображения хотя бы части условий эксперимента значительно сократит его описание и будет способствовать пониманию схем устройств и приборов.

Блок-схемы, отражающие основные формы взаимодействия между объектом исследования и различными устройствами для регистрации функций.

Многие функции организма можно исследовать без электронной аппаратуры и регистрировать процессы либо непосредственно, либо после некоторых преобразований. Примерами могут служить измерение ртутным термометром температуры, регистрация сердечных сокращений с помощью пишущего рычажка и кимографа, регистрация дыхания с использованием капсулы Марэ, плетизмография с применением водяного плетизмографа, определение пульса и т. д. Реальные схемы установок для плетизмографии, регистрации моторики желудка и записи дыхания приведены на рис.

Блок-схема системы, позволяющей регистрировать биоэлектрические процессы в организме, показана на рис. \, В. Она состоит из объекта исследования, отводящих электродов, усилителя, регистратора и блока питания. Регистрирующие системы такого рода используют для электрокардиографии, электроэнцефалографии, электрогастрографии, электромиографии и др.

При исследовании и регистрации с помощью электронной аппаратуры целого ряда неэлектрических процессов необходимо их предварительно преобразовать в электрические сигналы. Для этого используют различные датчики. Одни датчики сами способны генерировать электрические сигналы и не нуждаются в питании от источника тока, другим это питание необходимо. Величина сигналов датчика обычно невелика, поэтому для регистрации их необходимо предварительно усиливать. Системы с применением датчиков используют для баллистокардиографии, плетизмографии, сфигмографии, регистрации двигательной активности, кровяного давления, дыхания, определения газов в крови и выды-хаемом воздухе и т. д.

Если системы дополнить и согласовать с работой радиопередатчика, то становится возможным передавать и регистри-ровать физиологические функции на значительном расстоянии от объекта исследования. Этот метод получил название биотелеметрии. Развитие биотелеметрии определяется внедрением микроминиатюри-зации в радиотехнику. Она позволяет исследовать физиологические функции не только в лабораторных условиях, но и в условиях свободного поведения, во время трудовой и спортивной деятельности, независимо от расстояния между объектом исследования и исследователем.

Системы, предназначенные для воздействия на организм или его структурно-функциональные единицы, оказывают различные влияния: пусковые, стимулирующие и тормозящие. Методы и варианты воздействия могут быть самыми разнообразными.

При исследовании дистантных анализаторов стимулирующий импульс может восприниматься на расстоянии, в этих случаях стимулирующие электроды не нужны. Так, например, можно воздействовать светом на зрительный анализатор, звуком - на слуховой и различными запахами - на обонятельный.

В физиологических экспериментах в качестве раздражителя часто используют электрический ток, в связи с чем широкое распространение получили электронные импульсные стимуляторы и стимулирующие электроды. Электрическую стимуляцию применяют для раздражения рецепторов, клеток, мышц, нервных волокон, нервов, нервных центров и т. д. При необходимости может быть применена биотелеметрическая стимуляция (рис. 4, В). Причем воздей-ствия на организм могут быть как локальными, так и общими

Исследования физиологическихфункций проводят не только в состоянии покоя, но и при различныхфизических нагрузках. Последние могут создаваться либо. выполнением определенных упражнений (приседания, бег и т. д.), либо с помощью различных устройств (велоэргометр, бегущая дорожка и др.), дающих возможность точно дозировать нагрузку.

Регистрирующие и стимулирующие системы часто используют одновременно, что значительно расширяет возможности физиологических экспериментов. Эти системы можно комбинировать в различных вариантах.

ЭЛЕКТРОДЫ

В физиологических исследованиях электроды являются связующим звеном между объектом исследования и приборами. Они применяются для нанесения разряжения или регистрации (отведения) биоэлектрической активности клеток, тканей и органов, поэтому их принято подразделять на стимулирующие. Один и тот же электрод может быть использован и как стимулирую-щий, и как отводящий, так как принципиальной разницы между ними нет.

В зависимости от способа регистрации или раздражения различают биполярные и униполярные электроды. При биполярном способе чаще используют два одинаковых электрода, при униполярном - электроды различаются и по функциональному назначению, и по конструкции. В этом случае активный (дифферентный) электрод располагают в зоне отведения биопотенциалов или на участке ткани, который нужно стимулировать.

Активный электрод, как правило, имеет относительно небольшие размеры по сравнению с другим пассивным (индифферентным) электродом. Индифферентный электрод обычно фиксируют на некотором удалении от активного. При этом необходимо, чтобы зона фиксации индифферентного электрода либо не имела собственного потенциала (например, умерщвленный участок ткани, жидкая электропроводная среда, окружающая объект исследования), либо этот участок должен быть выбран с более низким и относительно стабильным потенциалом (например, мочка уха). Индифферентные электроды часто представляют собой пластины из серебра, олова, свинца или другого металла.

В зависимости от расположения электроды делятся на поверхностные и погружные. Поверхностные электроды фиксируют или на поверхности объекта исследования (например, при регистрации ЭКГ, ЭЭГ), или на отпрепарированных и обнаженных структурах (при стимуляции нерва, отведении вызванных потенциалов от поверхности коры головного мозга и т. п.).

Погружные электроды используют для исследования объектов, расположенных в глубине органов или тканей (например, при стимуляции нейронов, расположенных в подкорковых структурах головного мозга, или отведении от них биоэлектрической активности). Эти электроды имеют особую конструкцию, которая должна обеспечить хороший контакт с объектом исследования и надежную изоляцию остальной токопроводящей части электрода от окружающих тканей. Все электроды независимо от типа и способа их использования не должны оказывать вредного влияния на объект исследования.

Недопустимо, чтобы сами электроды становились источником потенциалов. Следовательно, электроды не должны иметь поляриза-ционных потенциалов, которые в ряде случаев могут значительно искажать результаты исследований. Величина поляризационного потенциала зависит от материала, из которого изготовлен электрод, а также свойств и параметров электрического тока.

Меньшую способность к поляризации имеют электроды из благо-родных металлов: золота, серебра и платины. Поляризация практически не возникает, если через электроды течет переменный или импульсный электрический ток с изменяющейся полярностью импульсов. Возможность поляризации электрода увеличивается при его взаимодействии с постоянным или импульсным монофазным током. Вероятность поляризации тем больше, чем больше сила тока, протекающего через электрод, и длительное время его действия. Она связана с электрохимическими процессами, происходящими между материалом электрода и окружающей его электролитической средой. В результате этого электроды приобретают определенный заряд, противоположный по знаку стимулирующему или отводимому току, что приводит к неконтролируемому положению условий эксперимен-та. Поэтому при воздействии на объект постоянным током и при отведении постоянных или медленно изменяющихся потенциалов используют неполяризующиеся электроды.

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5